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簡化復(fù)雜的熒光多孔板檢測方法
細胞凋亡或程序性細胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過程中以消除不需要的細胞，或者發(fā)生在成年人的愈合過程中，以消除身體的受損細胞，幫助預(yù)防癌癥。用多孔板進行的Caspase檢測實驗使研究人員能夠研究細胞凋亡的早期階段。在這篇文章中，我們展示了MICA如何與熒光多孔板測定一起應(yīng)用，以提供*時空相關(guān)性的數(shù)據(jù)，并將串?dāng)_降至zui di。
U2OS細胞在加入細胞凋亡誘導(dǎo)劑星形孢菌素后，在13小時延時成像過程中拍攝標(biāo)記了SiR Actin、TMRE、CellEvent™和DAPI的圖像。
熒光檢測的基礎(chǔ)知識
多孔板對于需要更高通量的實驗非常有用。它們能讓用戶收集384、96或24個不同的平行實驗（或樣品）的數(shù)據(jù) [1]?，F(xiàn)代檢測試劑盒通常用熒光探針或染料來標(biāo)記感興趣的蛋白，然后再用熒光顯微鏡對每個孔板中熒光標(biāo)記的樣品進行分析[2,3]。高通量的熒光多孔板檢測在神經(jīng)科學(xué)、癌癥研究和發(fā)育生物學(xué)等領(lǐng)域的很多實驗中都有廣泛的應(yīng)用。幸運的是，許多這類熒光檢測的試劑盒在市場上可以買到，這有助于大大簡化樣品制備，為用戶節(jié)省大量的時間和精力。
細胞凋亡和Caspase蛋白
細胞凋亡或程序性細胞死亡發(fā)生在生物體胚胎發(fā)育過程中以消除不需要的細胞，或在成年人的愈合過程中消除身體的受損細胞，幫助預(yù)防癌癥[4-6]。Caspases家族（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶）是一個大型的半胱氨酸蛋白酶家族，在細胞凋亡的啟動和執(zhí)行中起著重要作用[5,6]。啟動型caspases幫助啟動細胞凋亡，而執(zhí)行型caspases進行大量蛋白水解。Caspase-3和caspase-7都是執(zhí)行者型caspases[5,6,7]。caspase-3在細胞凋亡過程中有協(xié)調(diào)細胞結(jié)構(gòu)破壞的作用，而caspase-7有細胞脫離的作用[7]。
Caspase測定法
Caspase檢測可以研究細胞凋亡的早期階段。在這里，我們研究了caspase-3和capase-7被細胞毒性藥物（如星形孢菌素）激活的劑量依賴性。為了消除隨機效應(yīng)，在相同的條件下用不同濃度的一種藥物或多種藥物的組合，對多個檢測樣本進行了研究。具有統(tǒng)計學(xué)意義的結(jié)果通常需要重復(fù)實驗數(shù)次。
Caspase檢測中的挑戰(zhàn)
caspase檢測透露的主要是caspase激活級聯(lián)開始時的信息。然而，關(guān)于單個細胞的其他形態(tài)學(xué)或激活反應(yīng)的問題仍未得到解答。Caspase檢測中加入更多的熒光染色劑可以獲得更多的信息，例如在凋亡過程中的細胞骨架行為或xi bao se su c介導(dǎo)的凋亡小體的組裝導(dǎo)致caspase-3和caspase-7切割途徑的激活[8]。在caspase檢測中要快速收集所有熒光標(biāo)簽的信號，從而實現(xiàn)在規(guī)定時間間隔獲取整個樣本板上的數(shù)據(jù)，可能是很困難的。其次，很難快速并可靠地分離多達四個熒光標(biāo)簽的信號。最后，如果數(shù)據(jù)的獲取與caspase活性的檢測不是同步的，它們就不直接相關(guān)。
由于這些挑戰(zhàn)，在進行caspase測定，特別是在結(jié)合額外的標(biāo)記以獲得更多信息時，常常會有一些擔(dān)憂。激活反應(yīng)前后和形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)可能會丟失或沒有時空即位置和時間方面的相關(guān)性。另外，熒光標(biāo)簽之間的串?dāng)_也會導(dǎo)致對結(jié)果的誤解。
目前，大量的研究實驗室可能沒有現(xiàn)成的用于這些檢測工作的所有儀器和顯微鏡。這個問題通常通過使用多個研究小組和用戶的共享設(shè)備來解決，但這意味著可能需要很長時間才能獲得所需的儀器。
這些挑戰(zhàn)可能導(dǎo)致延遲獲得重要的、可量化的結(jié)果，而這些結(jié)果會影響根本性突破和獲得新的見解。
Mica介紹
Mica是全場景顯微成像分析平臺，它將研究人員需要的一切都統(tǒng)一在一個wan quan可控的、高度靈活的環(huán)境中，加速顯微鏡的工作流程，以便更快地獲得有意義的科學(xué)結(jié)果。通過使用這個顯微成像分析平臺，您可以從以下方面受益：
人人皆享：即使是沒有經(jīng)驗的用戶也能用MICA輕松設(shè)置復(fù)雜的檢測讀數(shù)。
觸手可及：MICA使得用戶能同時對4個標(biāo)記進行成像，具有*的時空相關(guān)性。
ji zhi簡化工作流程：MICA對4個標(biāo)記的同時采集以及后續(xù)AI驅(qū)動的數(shù)據(jù)分析都顯著減少了工作流程步驟。
方法
MICA用于熒光多孔板檢測來研究caspase-3和caspase-7在激活凋亡中的作用（圖1）。制備U2OS細胞相關(guān)樣品，最后用星形孢菌素處理以誘導(dǎo)細胞凋亡。本實驗有多個與凋亡早期階段相關(guān)的讀數(shù)。
結(jié)果
圖1結(jié)果顯示了星形孢菌素誘導(dǎo)的caspase-3和caspase-7的激活，在此之前是應(yīng)力纖維的形成和線粒體膜電位的耗盡。
用MICA實現(xiàn)了4種熒光標(biāo)記物的絕對時空相關(guān)性，由此可以對凋亡誘導(dǎo)的早期進行監(jiān)測（參考視頻1和圖2）。觀察到應(yīng)力纖維的形成與caspase-3和caspase-7激活開始時線粒體膜電位的喪失相吻合。DNA凝結(jié)直接跟隨caspase激活。
圖3為傳統(tǒng)寬場顯微鏡和MICA的時空多色采集對比。熒光標(biāo)記的同步檢測在研究線粒體動力學(xué)時，消除了觀察線粒體結(jié)構(gòu)和膜電位時的時空偽影。使用傳統(tǒng)寬場成像時，由序列采集產(chǎn)生的時空偽影會使測量結(jié)果失真，并影響結(jié)構(gòu)和功能的相關(guān)性。MICA的FluoSync技術(shù)能同時采集并確保時空相關(guān)性，采集時沒有偽影，膜電位與線粒體結(jié)構(gòu)正確相關(guān)。
與傳統(tǒng)的寬場顯微鏡不同的是Mica FluoSync[10]可以同時進行4色標(biāo)簽成像、寬光譜譜檢測和拆分[9] （參加圖4）。
參考資料
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W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems.
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S. Cullen, S. Martin, Caspase activation pathways: some recent progress, Cell Death Differ. (2009) vol. 16, iss. 7, pp. 935–938, DOI: 10.1038/cdd.2009.59.
F. Cutrale, S.E. Fraser, A New Method for Convenient and Efficient Multicolor Imaging: Interview, Science Lab (2022) Leica Microsystems.
FluoSync - a Fast & Gentle Method for Unmixing Multicolour Images: A streamlined approach for simultaneous multiplex fluorescent imaging using a single exposure, Science Lab (2022) Leica Microsystems.
